Rozdíl mezi klonováním a subklonováním

Klíčový rozdíl - klonování vs subklonování
 

Klonování a subklonování jsou molekulární biologické postupy, které vytvářejí geneticky identické buňky nebo organismy nesoucí příslušnou DNA nebo gen. Klonování je technika, která zahrnuje inzerci zainteresovaného genu nebo DNA do vektoru, jeho replikaci v hostitelské bakterii a produkci buněk nebo organismů, které jsou přesnými kopiemi genetického složení. Subklonování je technika, která zahrnuje inzerci požadovaného genu, který je již vložen do vektoru, do sekundárního vektoru, jeho replikace v hostitelské bakterii a produkce geneticky identických kopií buněk nebo organismů. Klíčovým rozdílem mezi klonováním a subklonováním je to, v klonování, požadovaný gen, jakmile je ligován do vektoru, pokračuje v klonovacím procesu, zatímco v subklonování je již klonovaný gen, který je předmětem zájmu, oddělen od rodičovského vektoru a znovu vložen do recipientního vektoru a pokračuje v procesu.

OBSAH
1. Přehled a klíčový rozdíl
2. Co je klonování
3. Co je subklonování
4. Porovnání bok po boku - klonování vs subklonování
5. Shrnutí

Co je klonování?

Klonování je postup, který produkuje geneticky identické organismy nebo buňky. Klonování se v přírodě děje ve formě asexuální reprodukce. Pokud nedochází k žádné genetické rekombinaci nebo změně, obdrží dceřiné buňky stejný genetický make-up jako rodič. Prokaryotické a eukaryotické organismy vytvářejí klony binárním štěpením, pučením, mitózou atd. V molekulární biologii je klonování genů nebo specifických fragmentů DNA populární metodou pro studium struktury a funkce dané konkrétní části DNA..

Hlavním cílem molekulárního klonování je vytvořit miliony kopií geneticky identických buněk nebo organismů nesoucích požadovaný fragment DNA (hlavně geny). Vytváří organismy s přesnými genetickými kopiemi jiného. Specifické geny jsou primárně klonovány v molekulárních studiích, aby se získaly strukturální a funkční informace a pro sekvenování DNA. Klonování se také široce používá pro produkci specifických proteinů nebo produktů ve velkém měřítku.

Postup klonování

Základní kroky klonovacího postupu jsou následující.

1. Identifikace a izolace požadovaného genu. (Amplifikace požadovaného genu pomocí PCR).
2. Restrikční štěpení požadovaného genu (restrikční endonukleáza štěpí gen).
3. Restrikční štěpení vektorové DNA. (Vektorová DNA je také řezána pomocí stejné restrikční endonukleázy).
4. Vložení genu do vektoru a tvorba rekombinantní molekuly.
5. Transformace rekombinantního vektoru na hostitelskou bakterii.
6. Izolace a identifikace transformovaných bakterií (plazmidový vektor by měl obsahovat selekční gen, nejčastěji gen rezistence na antibiotika ke screeningu transformovaných bakterií).
7. Exprese rekombinantního genu v hostiteli.

Obrázek_01: Klonování

Co je subklonování?

Subklonování je postup přesunu požadovaného genu z jednoho vektoru do jiného vektoru, aby se viděla exprese genu, aby se získala požadovaná funkčnost genu. V této metodě jsou zahrnuty dva vektory; jmenovitě rodičovský vektor a cílový vektor. Klonované vložky jsou při subklonování opět přesunuty do druhého vektoru. Cílem přenosu genu z prvního vektoru do druhého vektoru je získat něco, co by nemohlo být provedeno prvním vektorem, nebo separovat gen znovu v již klonovaném fragmentu DNA a exprimovat ho samostatně. V tomto postupu se na začátku používají restrikční enzymy.

Postup subklonování

Základní kroky subklonování jsou následující.

1. S pomocí restrikčních endonukleáz, separace požadované DNA v donorovém plazmidu (rodičovský vektor).
2. Amplifikace požadované DNA pomocí PCR.
3. Čištění produktu PCR (DNA zájmu) gelovou elektroforézou.
4. Otevření recipientního plazmidu stejnými restrikčními endonukleázami použitými k oddělení požadované DNA v rodičovském plazmidu.
5. Ligace požadované DNA (genu) do recipientního plazmidu za vzniku subklonovaného plazmidu.
6. Transformace subklonovaného vektoru na kompetentní hostitelskou bakterii.
7. Screening transformovaných buněk.
8. Čištění plazmidové DNA a použití pro sekvenování DNA nebo expresi genů k získání požadovaných produktů.

Subklonování se provádí v případech izolace jednoho genu z klonované skupiny genů nebo v případě, kdy je požadovaný gen povinen přenést do užitečného plazmidu, aby viděl přesnou funkci sledovaného genu.

Obrázek_02: Postup subklonování

Jaký je rozdíl mezi klonováním a subklonováním?

Klonování vs subklonování
Klonování je postup, který produkuje geneticky identické organismy nebo buňky.	Subklonování je postup přesunu požadovaného genu z jednoho vektoru do jiného vektoru, aby se viděla exprese genu pro získání požadované funkčnosti genu.
Proces
Oddělte požadovanou DNA od organismu a jednou vložte do vektoru a klonujte	Již klonovaná DNA je oddělena od prvního vektoru a vložena do druhého vektoru a klonována.
Vložit pohyb přes vektory
Nepřesunuje inzerty (DNA, které jsou předmětem zájmu) z jednoho vektoru do jiného vektoru.	Přesuňte vložky z nadřazeného vektoru do cílového vektoru.

Shrnutí - klonování vs subklonování

Klonování vytváří geneticky identické buňky nebo organismy s vloženým genem nebo DNA, která nás zajímá. Probíhá separací a inzercí požadované DNA do vektoru a expresí v hostitelské bakterii. Subklonování sdílí podobné kroky s klonováním. Při subklonování je však již klonovaný fragment DNA (požadovaný gen) vložen do vektoru a transformován do hostitelské bakterie. To je klíčový rozdíl mezi klonováním a subklonováním.

Reference

1. Lodish, Harvey. "Klonování DNA s plazmidovými vektory." Molekulární buněčná biologie. 4. vydání. U.S. National Library of Medicine, 1. ledna 1970. Web. 05.03.2017
2. "Subklonování." Wikipedia. Nadace Wikimedia, 14. února 2017. Web. 06.03.2017
3. "Subklonování." Subklonování | Články s otevřeným přístupem Časopisy s otevřeným přístupem Sborník z konference | Redaktoři | Autoři | Recenzenti | vědecké události. N.p., n.d. Web. 06.03.2017
4. Wackerhage, Henning. "Jak subklonovat." Jak subklonovat. N.p., 1. ledna 1970. Web. 06.03.2017

Obrázek se svolením

1. Postup molekulárního klonování - CNX OpenStax [CC BY 4.0], přes Wikimedia Commons
2. Postup subklonování - Autorem původního nahrávání byl Takometer na anglické Wikipedii (převeden z en.wikipedia na Commons.) [CC BY 2.5], prostřednictvím Wikimedia Commons