Rozdíl mezi klonováním genů a PCR

Klíčový rozdíl - klonování genů vs. PCR
 

Syntéza mnoha kopií DNA ze specifického fragmentu DNA se nazývá amplifikace DNA. Existují dva hlavní procesy amplifikace DNA, jmenovitě klonování genů a PCR. Klíčový rozdíl mezi klonováním genů a PCR je, genové klonování produkuje vícenásobné kopie specifického genu in vivo vytvořením rekombinantní DNA a růstem uvnitř hostitelské bakterie, zatímco PCR produkuje miliony kopií specifického fragmentu DNA in vitro podstupující opakované cykly denaturace a syntézy.

OBSAH
1. Přehled a klíčový rozdíl
2. Co je genové klonování
3. Co je to PCR
4. Porovnání bok po boku - klonování genů vs PCR
5. Shrnutí

Co je to Gene Cloning?

Klonování genu je technika používaná k lokalizaci a množení specifického genu z extrahované genomové DNA organismu prostřednictvím konstrukce rekombinantní DNA. Genomická DNA obsahuje tisíce různých genů kódovaných pro proteiny. Když je extrahována DNA, zahrnuje všechny možné geny, které může nést. Technika klonování genu umožnila detekci specifického genu z celkové DNA. Klonování genů proto slouží jako důležitý nástroj v molekulární biologii.

Vytvoření genomické knihovny organismu je nezbytné pro klonování genů, pokud neexistuje ponětí o umístění příslušného genu v DNA. Genomická knihovna se vytvoří pomocí následujících kroků.

Krok 1: Extrakce celkové DNA z organismu, který obsahuje požadovaný gen.

Krok 2: Restrikční digesce extrahované DNA za vzniku malých zvládnutelných fragmentů. Tento krok je usnadněn restrikčními endonukleázami.

Krok 3: Výběr vhodného vektoru a otevření DNA vektoru pomocí stejných restrikčních endonukleáz. Bakteriální plazmidy se běžně používají jako vektory k nesení cizí DNA. Plazmidy jsou malé kruhy DNA umístěné uvnitř bakterií.

Krok 4: Kombinace vektorové DNA a fragmentované DNA za vzniku molekuly rekombinantní DNA. Tento krok je řízen DNA ligázou.

Krok 5: Přenos rekombinantních molekul DNA do hostitelských bakterií. Tento krok se nazývá transformace a provádí se pomocí tepelného šoku.

Krok 5: Screening transformovaných bakteriálních buněk na kultivačním médiu. Na konci transformačního procesu se získá smíšená populace transformovaných a netransformovaných hostitelských buněk. Jako požadovaný gen zahrnuje pouze v transformovaných hostitelských buňkách. Proto je nutné vybrat transformované buňky. Výběr se provádí pomocí selektivních médií, která obsahují antibiotika. Na tomto screeningovém médiu rostou pouze transformované buňky, což umožňuje selekci.

Krok 6: Pěstování bakterií za účelem produkce genové knihovny. V tomto kroku se transformované hostitelské buňky zavedou do čerstvého kultivačního média, které poskytuje optimální požadavky na růst. Celkový počet kolonií na kultivačních destičkách představuje genomickou knihovnu tohoto organismu.

Krok 7: Rekombinantní molekula DNA obsahující požadovaný gen musí být testována z tisíců klonovaných fragmentů rekombinantní DNA. Toho lze dosáhnout použitím sond, které označují specifický gen nebo specifický protein, který je výsledkem tohoto genu.

Jakmile je z celkového počtu kolonií identifikován gen, který má zájem, obsahující bakteriální kolonii, je možné vyrobit miliony kopií rekombinantního plazmidu, který obsahuje gen.

Klonování genů se používá při zakládání genových knihoven, produkci speciálních proteinů, vitamínů, antibiotik, hormonů, sekvenování a mapování genomů organismů, vytváření vícenásobných kopií DNA jednotlivců v forenzních oborech atd..

Obrázek_1: Klonování genů

Co je to PCR?

Polymerázová řetězová reakce (PCR) je technika, která generuje velké množství kopií konkrétního fragmentu DNA. Exponenciální amplifikace specifické sekvence DNA se získá pomocí PCR pod in vitro podmínky. Tato technika je velmi výkonným nástrojem v molekulární biologii, protože může znásobit malý vzorek DNA do využitelného množství. PCR byla zavedena Kary Mullis v roce 1983 a tento oceněný vynález vytvořil obrovský pokrok v molekulární biologii.

Technika PCR sleduje opakované reakce PCR, jak je znázorněno na obrázku 02. Jedna reakce PCR sestává ze tří hlavních kroků, ke kterým dochází při třech různých teplotách; denaturace dvouvláknového na DNA při 94 ⁰C, žíhání primerů při 68 ⁰C a prodloužení provazce při 72 ⁰C. Proto, když se provádí PCR, je třeba pro správnou replikaci vysoce udržovat kolísání teploty. PCR se provádí v PCR stroji uvnitř zkumavek PCR. PCR zkumavky jsou naplněny správnými směsmi PCR obsahujícími templátovou DNA, Taq polymerázu, primery, dNTP a pufr. Denaturace dvouvláknové DNA na jednovláknovou DNA se provádí přerušením vodíkových vazeb mezi komplementárními bázemi při 94 - 98 ⁰C. Potom jsou jednotlivé řetězce templátové DNA exponovány pro primery. Měl by být poskytnut pár primerů (vpřed a vzad) a měly by být termostabilní, aby tolerovaly vysoké teploty. Primery jsou jednovláknové krátké DNA sekvence komplementární ke koncům cílového DNA fragmentu. V PCR se používají syntetické primery. Primery se vážou s komplementárními bázemi vzorku DNA a zahajují syntézu nového vlákna. Tento krok je katalyzován enzymem nazývaným Taq polymeráza; termostabilní enzym DNA polymerázy izolovaný z Thermus auqaticus. Když jsou k dispozici primery a nukleotidy (stavební bloky), Taq polymeráza konstruuje nový řetězec DNA komplementární k templátové DNA. Na konci programu PCR je amplifikovaný fragment DNA pozorován gelovou elektroforézou. Pokud je vyžadována další analýza, produkt PCR je purifikován z gelu.

PCR je velmi užitečná pro diagnostiku a monitorování genetických a získaných nemocí, identifikaci zločinců (v oblasti forenzní), studium struktury a funkce cílového segmentu DNA, sekvenování a mapování genomů organismů atd. PCR se stala rutinní laboratorní technika ve výzkumných laboratořích lékařské a molekulární biologie mezi vědci, protože má širokou škálu aplikací.

Obrázek_2: Polymerázová řetězová reakce

Jaký je rozdíl mezi genovým klonováním a PCR?

Klonování genů vs PCR
Klonování genu je proces vytváření více kopií specifického genu in vivo prostřednictvím rekombinantní DNA a transformace do hostitelské bakterie.	Technika PCR vytváří více kopií konkrétní sekvence DNA in vitro opakovanými cykly PCR reakcí.
Požadavek na konstrukci rekombinantní DNA
Produkuje se rekombinantní DNA, aby se lokalizoval gen.	Rekombinantní DNA není produkována.
Potřeba práce
Tento proces je náročný na pracovní sílu.	Intenzivní práce není nutná.
In vivo nebo in vitro proces
Konstrukce rekombinantní DNA je in vitro a amplifikace DNA je in vivo.	K amplifikaci DNA dochází úplně in vitro.

Shrnutí - Gene Cloning vs PCR

Klonování genu a PCR jsou dvě metody používané pro amplifikaci DNA. PCR je in vitro proces, který vytváří vícenásobné kopie DNA konkrétního fragmentu DNA bez použití rekombinantní DNA a hostitelského organismu. Klonování genu je primárně in vivo proces, který má za následek vytvoření více kopií genu, který má zájem, v hostitelském organismu konstrukcí rekombinantní DNA. To je rozdíl mezi genovým klonováním a PCR.

Odkaz:
1. Griffiths, Anthony JF. "Klonování specifického genu." Moderní genetická analýza. U.S. National Library of Medicine, 01.01.1999. Web. 22 únor 2017
2. „Polymerázová řetězová reakce (PCR).“ Národní centrum pro biotechnologické informace. U.S. National Library of Medicine, n.d. Web. 22 únor 2017

Obrázek se svolením:
1. „Obrázek 17 01 06“ od CNX OpenStax - (CC BY 4.0) přes Commons Wikimedia
2. „PCR“ od Madprime - vlastní práce (CC BY-SA 3.0) přes Commons Wikimedia