Rozdíl mezi Maxamem Gilbertem a Sangerovým sekvenováním

Klíčový rozdíl - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
 

Nukleotidy jsou základní strukturální jednotky a stavební bloky DNA. Molekula DNA se skládá z polynukleotidového řetězce. V DNA se nacházejí čtyři různé nukleotidy. Tyto nukleotidy se skládají ze čtyř různých dusíkatých bází s názvem A (adenin), G (guanin), C (cytosin), T (thymin). Pořadí nukleotidů v molekule DNA má velký význam, protože kóduje důležitou genetickou informaci pro růst a vývoj organismů. Sekvenování DNA se týká procesu, který určuje přesnou nukleotidovou sekvenci DNA. Existují různé metody sekvenování DNA. Sekvenování Maxam Gilbert a sekvenování Sanger DNA jsou dvě metody sekvenování DNA, které patří k sekvenování první generace. Postup sekvenování Maxama Gilberta určuje základní sekvenci chemickým štěpením 5 'koncových značených fragmentů DNA přednostně na každém ze čtyř nukleotidů a gelovou elektroforézou. Sangerův postup sekvenování určuje nukleotidovou sekvenci syntetizováním jednovláknové DNA pomocí DNA polymerázy a dideoxynukleotidů a gelové elektroforézy. To je klíčový rozdíl mezi Maxamem Gilbertem a Sangerovým sekvenováním.

OBSAH
1. Přehled a klíčový rozdíl
2. Co je Maxam Gilbert
3. Co je Sangerovo sekvenování
4. Srovnání bok po boku - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
5. Shrnutí

Co je Maxam Gilbert Sekvenování?

Maxam Gilbert sekvenování, také známý jako metoda chemického sekvenování, je technika, která byla vyvinuta ke stanovení pořadí nukleotidů v DNA. Tato metoda byla zavedena Walterem Gilbertem a Alanem Maxamem v roce 1976 a stala se populární, protože může být prováděna přímo s vyčištěnou DNA. Metoda Maxama Gilberta patří k první generaci sekvenování DNA a byla to první metoda sekvenování, kterou vědci široce využívali.

Základní princip této metody spočívá v omezení konečně značených fragmentů DNA na specifických bázích chemickými látkami a podmínkami specifickými pro bázi a separaci značených fragmentů elektroforézou, jak je znázorněno na obrázku 01. Fragmenty jsou separovány podle své velikosti na gel. Protože jsou fragmenty značeny, lze sekvenci molekuly DNA snadno odvodit.

Maxam gilbertova metoda používá chemikálie specifické pro základní látky k rozbití DNA na specifických základech. K selektivnímu napadení purinů a pyrimidinů se používají dvě běžné chemikálie s názvem dimethylsulfát a hydrazin.

Metoda sekvenování Maxama Gilberta se provádí několika kroky následovně.

1. Čištění DNA sekvence pomocí restrikčních endonukleáz
2. Značení konců fragmentů DNA přidáním radioaktivních fosfátů
3. Čištění značených fragmentů z neoznačených fragmentů gelovou elektroforézou
4. Separace DNA značené na konci do čtyř zkumavek a samostatné ošetřování chemikáliemi specifickými pro základní látky
5. Elektroforéza obsahu každé zkumavky na samostatných liniích na gelu a separace fragmentů podle jejich délky.
6. Detekce fragmentů autoradiografem.

Obrázek 01: Maxam Gilbert Sekvenování

Co je Sangerovo sekvenování?

Sanger Sequencing je metoda sekvenování vyvinutá Frederickem Sangerem a jeho kolegy v roce 1977 k určení základní sekvence daného fragmentu DNA. Je také známý jako sekvenční zakončení řetězce nebo Dideoxy metoda sekvenování. Tato metoda pracuje na principu selektivního začlenění dideoxynukleotidů zakončujících řetězec (ddNTP), jako je ddGTP, ddCTP, ddATP a ddTTP, DNA polymerázou během syntézy jednovláknové DNA pro ukončení tvorby řetězce. Dideoxynukleotidy postrádají 3 'OH skupiny pro tvorbu fosfodiesterových vazeb se sousedními nukleotidy. Vytváření vláken se tedy zastaví, jakmile je ddNTP začleněn do nově vytvářejících se vláken během sekvenačního procesu.

V této metodě se provádějí čtyři oddělené reakce syntézy DNA (PCR) ve čtyřech samostatných zkumavkách s jedním typem ddNTP. Další požadavky jsou dodávány také pro zkumavky pro PCR, včetně primerů, dNTP, Taq polymerázy, specifických podmínek atd. Čtyři oddělené reakce se provádějí ve čtyřech zkumavkách se čtyřmi směsmi. Po PCR reakcích jsou výsledné DNA fragmenty tepelně denaturovány a separovány gelovou elektroforézou. Poté jsou fragmenty vizualizovány pomocí buď značeného (radioaktivního nebo fluorescenčního) primeru nebo dNTP, jak je znázorněno na obrázku 02.

Obrázek 02: Sekvenování Sangerů

Jaký je rozdíl mezi Maxamem Gilbertem a Sangerovým sekvenováním?

Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Sekvence Maxam Gilbert je první technika vyvinutá pro sekvenování DNA.	Metoda Sangerova sekvenování byla zavedena po sekvenční metodě Maxam Gilbert.
Používání
Tato metoda se používá jen zřídka.	Sangerovo sekvenování se běžně používá pro sekvenování.
Použití nebezpečných chemických látek
Používá nebezpečné chemikálie.	Použití nebezpečných chemikálií je ve srovnání s metodou Maxam Gilbert omezené.
Označování pro detekci
Tato metoda používá radioaktivní P32 pro značení konců fragmentů DNA.	Sangerovo sekvenování používá radioaktivně nebo fluorescenčně značené ddNTP.

Shrnutí - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing

Sekvence Maxam Gilbert a Sanger jsou dva typy technik sekvenování DNA, které spadají pod sekvenování DNA první generace. Sekvenování Maxam Gilberta je první metoda zavedená pro sekvenování DNA v roce 1976 a provádí se tím, že se fragmenty DNA označené koncovkou rozbijí chemikáliemi specifickými pro danou bázi. Proto je znám jako chemické sekvencování. Sangerova sekvenční metoda byla zavedena v roce 1977 a je založena na ddNTP řízených reakcích zakončení řetězce. Sangerova metoda sekvencování populární než Maxam Gilbertova metoda kvůli několika nevýhodám metody Maxam Gilbert, jako je nadměrná spotřeba času, použití nebezpečných chemikálií atd. To je rozdíl mezi Maxamem Gilbertem a Sangerovým sekvenováním.

Reference:
1.Maxam, A. M. a Walter Gilbert. "Nová metoda pro sekvenování DNA." Sborník Národní akademie věd. National Acad Sciences, 9. prosince 1976. Web. 30. března 2017
2. Heather, James M. a Benjamin Chain. "Posloupnost sekvencerů: Historie sekvenování DNA." Genomika. Academic Press, leden 2016. Web. 30. března 2017
3.Pareek, Chandra Shekhar, Rafal Smoczynski a Andrzej Tretyn. "Technologie sekvenování a sekvenování genomu." Žurnál aplikované genetiky. Springer-Verlag, listopad 2011. Web. 30. března 2017

Obrázek se svolením:
1. „Maxam gilbertův postup“ Několikrát na anglické Wikipedii (CC BY 3.0) prostřednictvím Commons Wikimedia
2. „Sangerovo sekvenování“ od Estevezje - vlastní práce (CC BY-SA 3.0) přes Commons Wikimedia