Rozdíl mezi sekvencemi Microarray a RNA

Klíčový rozdíl - Microarray vs RNA Sequencing
 

Transcriptome představuje celý obsah RNA přítomné v buňce včetně mRNA, rRNA, tRNA, degradované RNA a nedegradované RNA. Profilování transkriptomu je důležitý proces, aby bylo možné porozumět buněčným poznatkům. Existuje několik pokročilých metod pro transkripční profilování. Microarray a RNA sekvenování jsou dva typy technologií vyvinutých pro analýzu transkriptu. Klíčový rozdíl mezi mikročipem a sekvenováním RNA je ten microarray je založen na hybridizačním potenciálu předem navržených značených sond s cílovými sekvencemi cDNA, zatímco RNA sekvenování je založeno na přímém sekvenování řetězců cDNA pokročilými technikami sekvenování, jako je NGS. Microarray se provádí s předchozím vědomím o sekvencích a sekvenování RNA se provádí bez předchozí znalosti o sekvencích.

OBSAH
1. Přehled a klíčový rozdíl
2. Co je Microarray
3. Co je to sekvenování RNA
4. Porovnání vedle sebe - Microarray vs RNA Sequencing
5. Shrnutí

Co je Microarray?

Microarray je robustní, spolehlivá a vysoce výkonná metoda použitá pro profilování transkriptů vědci. Jedná se o nejpopulárnější přístup k analýze transkriptů. Jedná se o nízkonákladovou metodu, která závisí na hybridizačních sondách.

Tato technika začíná extrakcí mRNA ze vzorku a konstrukcí cDNA knihovny z celkové RNA. Poté je smíchán s fluorescenčně značenými předem navrženými sondami na pevném povrchu (bodová matrice). Komplementární sekvence hybridizují se značenými sondami v mikročipu. Poté je mikročip promyt a promítán a obraz je kvantifikován. Shromážděná data by měla být analyzována, aby se získaly profily relativního vyjádření.

Intenzita sond microarray se předpokládá, že je úměrná množství transkriptů ve vzorku. Přesnost techniky však závisí na navržených sondách, předchozí znalosti sekvence a afinitě sond pro hybridizaci. Technologie microarray má tedy omezení. Technika microarray nelze provádět s přepisy s nízkou četností. Nedokáže rozlišit izoformy a identifikovat genetické varianty. Protože tato metoda závisí na hybridizaci sond, vyskytují se v mikročipové technice některé problémy spojené s hybridizací, jako je křížová hybridizace, nespecifická hybridizace atd..

Obrázek 01: Microarray

Co je to sekvenování RNA?

RNA brokovniceRNA seq) je nedávno vyvinutá celá technika transkriptomového sekvenování. Je to rychlá a vysoce výkonná metoda transkripčního profilování. Přímo kvantifikuje expresi genů a vede k hloubkovému zkoumání transkriptomu. RNA seq nezávisí na předem navržených sondách nebo na předchozí znalosti sekvencí. Proto metoda RNA seq má vysokou citlivost a schopnost detekovat nové geny a genetické varianty.

Metoda sekvenování RNA se provádí několika kroky. Celková RNA buňky musí být izolována a fragmentována. Poté musí být pomocí reverzní transkriptázy připravena knihovna cDNA. Každý řetězec cDNA musí být ligován s adaptéry. Potom musí být ligované fragmenty amplifikovány a purifikovány. Nakonec musí být pomocí metody NGS provedeno sekvenování cDNA.

Obrázek 02: Sekvenování RNA

Jaký je rozdíl mezi sekvenováním Microarray a RNA?

Microarray vs RNA Sequencing
Microarray je robustní, spolehlivá a vysoce výkonná metoda.	RNA sekvenování je přesná a vysoce výkonná metoda.
Náklady
Jedná se o nízkonákladovou metodu.	Toto je nákladná metoda.
Analýza velkého počtu vzorků
To usnadňuje analýzu velkého počtu vzorků současně.	To usnadňuje analýzu velkého počtu vzorků.
Analýza dat
Analýza dat je komplexní.	Tato metoda generuje více dat; proces je tedy složitější.
Předchozí znalosti o sekvencích
Tato metoda je založena na hybridizačních sondách, takže je nutná předchozí znalost sekvencí.	Tato metoda nezávisí na znalosti předchozí sekvence.
Strukturální variace a nové geny
Tato metoda nemůže detekovat strukturální variace a nové geny.	Tato metoda může detekovat strukturální variace, jako je fúzování genů, alternativní sestřih a nové geny.
Citlivost
To nemůže detekovat rozdíly v expresi izoforem, takže má omezenou citlivost.	To má vysokou citlivost.
Výsledek
To může mít za následek pouze relativní úrovně exprese. To nedává absolutní kvantifikaci genové exprese.	Poskytuje absolutní a relativní úrovně vyjádření.
Opakovaná analýza dat
To musí být znovu spuštěno, aby bylo možné znovu provést analýzu.	Sekvenční data lze znovu analyzovat.
Potřeba specifického personálu a infrastruktury
Specifická infrastruktura a personál nejsou pro mikročip vyžadovány.	Specifická infrastruktura a personál vyžadovaný sekvenováním RNA.
Technické problémy
Technika Microarray má technické problémy, jako je křížová hybridizace, nespecifická hybridizace, omezená rychlost detekce jednotlivých sond atd..	Technika RNA seq vylučuje technické problémy, jako je křížová hybridizace, nespecifická hybridizace, omezená rychlost detekce jednotlivých sond atd..
Předpojatosti
Jedná se o zkreslenou metodu, protože závisí na hybridizaci.	Předpojatost je ve srovnání s mikročipem nízká.

Shrnutí - Microarray vs RNA Sequencing

Metody sekvenování Microarray a RNA jsou platformy s vysokou propustností vyvinutou pro profilování transkriptu. Obě metody poskytují výsledky, které jsou vysoce korelovány s profily genové exprese. Sekvenování RNA má však výhodu oproti mikročipu pro analýzu genové exprese. RNA sekvenování je citlivější metodou pro detekci transkriptů s nízkou četností než mikročip. RNA sekvenování také umožňuje rozlišení mezi izoformami a identifikaci genových variant. Nicméně, microarray je běžnou volbou většiny vědců, protože sekvenování RNA je nová a nákladná technika s výzvami pro ukládání dat a komplexní analýzu dat..

Reference:
1.Wang, Zhong, Mark Gerstein a Michael Snyder. "RNA-Seq: revoluční nástroj pro transkriptomiku." Recenze přírody. Genetika. US National Library of Medicine, leden 2009. Web. 14. března 2017
2.Rogler, Charles E., Tatyana Čajkovskaja, Raquel Norel, Aldo Massimi, Christopher Plescia, Eugeny Rubashevsky, Paul Siebert a Leslie E. Rogler. "RNA exprese microarrays (REMs), vysoce výkonná metoda k měření rozdílů v genové expresi v různých biologických vzorcích." Výzkum nukleových kyselin. Oxford University Press, 1. ledna 2004. Web. 15. března 2017
3. Zhao, Shanrong, Wai-Ping Fung-Leung, Anton Bittner, Karen Ngo a Xuejun Liu. "Srovnání RNA-Seq a Microarray v transkripčním profilování aktivovaných T buněk." ZADAT JEDNU. Veřejná knihovna vědy, leden 2014. Web. 15. března 2017

Obrázek se svolením:
1. “Journal.pcbi.1004393.g002” Malachiáš Griffith, Jason R. Walker, Nicholas C. Spies, Benjamin J. Ainscough, Obi L. Griffith - (CC BY 2.5) přes Commons Wikimedia
2. „Microarray“ od Bill Bransona (Fotografa) - National Cancer Institute (Public Domain) prostřednictvím Commons Wikimedia