Rozdíl mezi NGS a Sangerovým sekvenováním

Key Difference - NGS vs. Sanger Sequencing
 

Sekvenování nové generace (NGS) a Sangerova sekvenování jsou dva typy technik sekvenování nukleotidů vyvinutých v průběhu času. Sangerova sekvenční metoda byla po mnoho let široce používána a NGS ji nedávno nahradila kvůli svým výhodám. Klíčovým rozdílem mezi NGS a Sangerovým sekvenováním je to NGS pracuje na principu sekvenování milionů sekvencí současně rychlým způsobem prostřednictvím sekvenčního systému, zatímco Sangerova sekvenování funguje na principu ukončení řetězce kvůli selektivní inkorporaci dideoxynukleotidů enzymem DNA polymerázy během replikace DNA a výsledné separaci fragmentů kapilárou elektroforéza.

OBSAH
1. Přehled a klíčový rozdíl
2. Co je nukleotidové sekvenování
3. Co je NGS
4. Co je Sangerovo sekvenování
5. Srovnání bok po boku - NGS vs Sanger Sequencing
6. Shrnutí

Co je nukleotidové sekvenování?

Genetická informace je uložena v nukleotidových sekvencích DNA nebo RNA organismu. Proces stanovení správného pořadí nukleotidů (pomocí čtyř bází) v daném fragmentu (v genu, klastru genů, chromozomu a úplném genomu) je známý jako sekvenování nukleotidů. V genomických studiích, forenzních studiích, virologii, biologické systematice, lékařské diagnóze, biotechnologii a v mnoha dalších oblastech je velmi důležité analyzovat strukturu a funkci genů. Vědci existují různé typy sekvenčních metod. Mezi nimi, Sangerovo sekvenování vyvinutý Frederickem Sangerem v roce 1977 byl široce používán a popularizován po dlouhou dobu až do Sekvenování příští generace vyměnil ji.

Co je NGS?

Sekvenování nové generace (NGS) je termín používaný k označení moderních vysoce výkonných sekvenčních procesů. Popisuje řadu různých moderních sekvenčních technologií, které revolucionizovaly genomická studia a molekulární biologii. Těmito technikami jsou sekvenování Illumina, Roche 454, sekvenování Ion Proton a SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation Detection). Systémy NGS jsou rychlejší a levnější. V NGS systémech se používají čtyři hlavní metody sekvenování DNA; pyrosekvenování, sekvenování syntézou, sekvenování ligací a iontovým polovodičovým sekvenováním. Paralelně lze sekvenovat velké množství řetězců DNA nebo RNA (miliony). To umožňuje sekvenování celého genomu organismů v krátkém časovém období, na rozdíl od Sangerova sekvenování, které zabere více času.

NGS má mnoho výhod oproti konvenční Sangerově metodě sekvenování. Jedná se o vysokorychlostní, přesnější a nákladově efektivní postup, který lze provést s malou velikostí vzorku. NGS lze použít v metagenomických studiích, při detekci variací v rámci jednotlivého genomu v důsledku inzercí a delecí atd. A při analýze genových expresí.

Obrázek_1: Vývoj v sekvenování NGS

Co je Sangerovo sekvenování?

Sanger Sequencing je metoda sekvenování vyvinutá Frederickem Sangerem a jeho kolegy v roce 1977 k určení přesného pořadí nukleotidů daného fragmentu DNA. Je také známý jako sekvenční zakončení řetězce nebo Dideoxy sekvenování. Pracovním principem této metody je ukončení syntézy vláken selektivní inkorporací dideoxynukleotidů zakončujících řetězec (ddNTP), jako je ddGTP, ddCTP, ddATP a ddTTP, DNA polymerázou během replikace DNA. Normální nukleotidy mají 3 'OH skupiny pro vytvoření fosfodiesterové vazby mezi sousedními nukleotidy, aby pokračovaly ve formování vlákna. Nicméně, ddNTPs postrádají tuto 3 'OH skupinu a nejsou schopny vytvářet fosfodiesterové vazby mezi nukleotidy. Proto je prodloužení řetězce zastaveno.

V tomto způsobu slouží jednovláknová DNA, která má být sekvenována, jako templátové vlákno in vitro Syntéza DNA. Dalšími požadavky jsou oligonukleotidový primer, deoxynukleotidové prekurzory a enzym DNA polymeráza. Pokud jsou známé hraniční konce cílového fragmentu, mohou být primery snadno navrženy pro replikaci DNA. Ve čtyřech samostatných zkumavkách se provádí čtyři oddělené reakce syntézy DNA. Každá zkumavka má samostatné ddNTP, spolu s dalšími požadavky. Z konkrétního nukleotidu se přidá směs dNTP a ddNTP. Podobně se provádějí čtyři oddělené reakce ve čtyřech zkumavkách se čtyřmi směsmi. Po reakcích se provede detekce fragmentů DNA a konverze vzoru fragmentů na sekvenční informace. Výsledné fragmenty DNA jsou tepelně denaturovány a separovány gelovou elektroforézou. Pokud se použijí radioaktivní nukleotidy, lze pruhování v polyakrylamidovém gelu vizualizovat autoradiografií. Když tato metoda používá fluorescenčně značené dideoxynukleotidy, může být zmírněna dolů odečtením gelu a prošla paprskem laseru, který má být detekován fluorescenčním detektorem. Abychom se vyhnuli chybám, které mohou nastat, když je sekvence čtena okem a zadána ručně do počítače, tato metoda se vyvinula v použití automatizovaného sekvenceru spojeného s počítačem.

Toto je metoda použitá k sekvenování DNA z projektu Human Genome. Tato metoda se stále používá s pokročilými úpravami, protože poskytuje přesné informace o sekvenci, přestože je to nákladný a pomalý proces.

Obrázek_2: Sangerovo sekvenování

Jaký je rozdíl mezi NGS a Sangerovým sekvenováním?

NGS vs Sanger Sequencing
Sekvenování nové generace (NGS) se týká moderních vysoce výkonných sekvenčních procesů. Popisuje řadu různých moderních technologií sekvencování	Sekvence Sanger je sekvenční metoda vyvinutá Frederickem Sangerem k určení přesného pořadí nukleotidů daného fragmentu DNA.
Efektivita nákladů
NGS je levnější proces, protože snižuje čas, sílu člověka a chemikálie.	Je to nákladný proces, protože to vyžaduje čas, sílu člověka a více chemikálií.
Rychlost
To je rychlejší, protože jak chemické detekce, tak detekce signálu mnoha řetězců probíhají paralelně.	To je časově náročné, protože chemická detekce a detekce signálu se děje jako dva oddělené procesy a pouze na řetězci lze číst najednou.
Spolehlivost
NGS je spolehlivý.	Sangerovo sekvenování je méně spolehlivé
Velikost vzorku
NGS vyžaduje menší množství DNA.	Tato metoda vyžaduje velké množství templátové DNA.
DNA báze na sekvenovaný fragment
Počet DNA bází na sekvenovaný fragment je nižší než Sangerova metoda	Generující sekvence jsou delší než NGS sekvence.

Shrnutí - NGS vs Sanger Sequencing

NGS a Sanger Sequencing jsou techniky nukleotidového sekvenování široce používané v Molecular Biology. Sangerovo sekvenování je metoda časného sekvenování, která byla nahrazena NGS. Hlavní rozdíl mezi NGS a Sangerovým sekvenováním je, že NGS je vysokorychlostní, přesnější a nákladově efektivnější proces než Sangerovo sekvenování. Obě techniky způsobily hlavní ohniska genetiky a biotechnologie.

Odkaz:
1. Nowrousian, Minou. "Techniky sekvenování příští generace pro eukaryotické mikroorganismy: řešení biologických problémů založená na sekvenování." Eukaryotická buňka. Americká společnost pro mikrobiologii, září 2010. Web. 18. února 2017
2. Sanger, F., S. Nicklen, a A. R. Coulson. "Sekvenování DNA s inhibitory zakončení řetězce." Sborník Národní akademie věd 74.12 (1977): 5463-467. Web.
3. Liu, Lin, Yinhu Li, Siliang Li, Ni Hu, Yimin He, Ray Pong, Danni Lin, Lihua Lu a Maggie Law. "Porovnání sekvenačních systémů nové generace." Journal of Biomedicine and Biotechnology 2012 (2012): 1-11. Web.

Obrázek se svolením:
“Sanger-sekvenování” Estevezj - vlastní práce (CC BY-SA 3.0) přes Commons Wikimedia 
„Vývoj v sekvenování příští generace“ od Nederbragt, Lex (2012) - (CC BY 3.0) přes Commons Wikimedia