Rozdíl mezi severním jižním a západním blotováním

Klíčový rozdíl - severní vs jižní vs západní blotting
 

Detekce specifických sekvencí DNA, RNA a proteinů je nezbytná pro různé typy studií v molekulární biologii. Gelová elektroforéza je technika, která odděluje DNA, RNA a proteiny podle jejich velikosti. Z profilů gelu jsou speciální sekvence DNA, RNA sekvence nebo protein detekovány speciálními technikami zvanými blotting a hybridizace se značenými sondami. Existují tři různé typy blotovacích metod, jmenovitě jižní, severní a západní. Klíčový rozdíl mezi severním jižním a západním přenosem spočívá v typu molekuly, kterou ze vzorku detekuje. Southern blotting je metoda, která detekuje specifickou sekvenci DNA ze vzorku DNA. Northern blotting je technika, která detekuje specifickou sekvenci RNA ze vzorku RNA. Western blotting je metoda, která detekuje specifický protein ze vzorku proteinu.

OBSAH
1. Přehled a klíčový rozdíl
2. Co je Southern Blotting
3. Co je Northern Blotting
4. Co je Western Blotting
5. Srovnání bok po boku - severní vs jižní vs západní blotting
6. Shrnutí

Co je Southern Blotting?

Technika Southern blotting byla vyvinuta E. M. Southern v roce 1975 pro identifikaci specifické sekvence DNA ze vzorku DNA. Toto je první technika přenosu dat zavedená v molekulární biologii. To umožnilo detekci specifických genů z DNA, specifických fragmentů z DNA atd. Existuje několik kroků, které se účastní techniky Southern blotting. Jsou následující.

1. DNA je izolována ze vzorku a štěpena restrikčními endonukleázami.
2. Štěpený vzorek je separován elektroforézou na agarózovém gelu.
3. Fragmenty DNA v gelu jsou denaturovány na jednotlivé řetězce pomocí alkalického roztoku.
4. Jednovláknová DNA se přenáší na nitrocelulózovou filtrační membránu kapilárním přenosem.
5. Přenesená DNA je fixována trvale na membráně.
6. Fixovaná DNA na membráně je hybridizována se značenými sondami.
7. Nenavázaná DNA se promyje z membrány.
8. Rentgenový film je vystaven membráně a je připraven autoradiograf.

Southern blotting se používá pro různé aspekty molekulární biologie. Je užitečný při mapování RFLP, forenzních studiích, methylaci DNA při genové expresi, detekci mutovaných genů při genetických poruchách, otiscích DNA atd..

Obrázek 01: Southern Blotting Technique

Co je Northern Blotting?

Northern blotting je metoda navržená k detekci specifické RNA sekvence nebo mRNA sekvence ze vzorku ke studiu genové exprese. Tato technika byla vyvinuta Alwinem, Kempem a Starkem v roce 1979. Liší se od technik na severním a západním skvrnu v důsledku několika kroků. Tato technika je však také prováděna gelovou elektroforézou, blotováním a hybridizací se specifickými značenými sondami a detekcí. Technika Northern blotování se provádí následujícím způsobem.

1. RNA je extrahována ze vzorku a separována gelovou elektroforézou.
2. RNA je přenesena z gelu na blotovací membránu a fixována.
3. Membrána je ošetřena značenou sondou připravenou z cDNA nebo RNA (sonda je komplementární ke specifické sekvenci ve vzorku).
4. Sonda je inkubována s membránou za účelem vazby se specifickou sekvencí.
5. Nevázané sondy se spláchnou.
6. Hybridizované fragmenty jsou detekovány autoradiografem.

Northern blotting je důležitým nástrojem pro detekci a kvantifikaci hybridizované mRNA, studium degradace RNA, vyhodnocení poločasu RNA, detekci sestřihu RNA, studium exprese genu atd..

Obrázek 02: Northern Blotting

Co je Western Blotting?

Western blotting je metoda detekce specifického proteinu z proteinové směsi pomocí značené protilátky. Proto je western blot také známý jako imunoblot. Tuto techniku ​​zavedl Towbin et al v roce 1979 a nyní se běžně provádí v laboratoři pro analýzu proteinů. Kroky jsou následující.

1. Proteiny jsou extrahovány ze vzorku
2. Proteiny jsou separovány podle své velikosti pomocí elektroforézy na polyakrylamidovém gelu
3. Separované molekuly jsou přeneseny do PVDF membrány nebo nitrocelulózové membrány elektroporací
4. Membrána je blokována pro nespecifickou vazbu s protilátkami
5. Přenesené proteiny jsou vázány s primární protilátkou (enzymem značené protilátky).
6. Membrána se promyje, aby se odstranily nespecificky vázané primární protilátky
7. Navázané protilátky se detekují přidáním substrátu a detekcí vytvořené barevné sraženiny

Western blotting je užitečný při detekci anti-HIV protilátek ve vzorku lidského séra. Western blot lze také použít jako potvrzující test na infekci hepatitidou B a definitivní test na chorobu šílených krav.

Obrázek 03: Western Blotting

Jaký je rozdíl mezi severním jižním a západním blotováním??

Northern vs Southern vs Western Blotting
Typ detekované molekuly
Northern Blotting	Northern blotting detekuje specifickou sekvenci RNA ze vzorku RNA.
Southern Blotting	Southern blotting detekuje specifickou sekvenci DNA ze vzorku DNA.
Western Blotting	Western blot detekuje specifický protein ze vzorku proteinu.
Typ gelu
Northern Blotting	Používá se gel Agarose / formaldehyd.
Southern Blotting	Používá se gel Agarose.
Western Blotting	Používá se polyakrylamidový gel.
Metoda blotování
Northern Blotting	Toto je kapilární převod.
Southern Blotting	Toto je kapilární převod.
Western Blotting	Jedná se o elektrický přenos.
Použité sondy
Northern Blotting	Sondy cDNA nebo RNA byly radioaktivně nebo neradioaktivně značeny.
Southern Blotting	DNA sondy jsou značeny radioaktivně nebo neradioaktivně.
Western Blotting	Jako sondy se používají primární protilátky.
Detekční systém
Northern Blotting	To se provádí autoradiografem nebo detekcí změny světla nebo barvy.
Southern Blotting	To se provádí autoradiografem, detekcí změny světla nebo barev.
Western Blotting	To se provádí pomocí detekce změny světla nebo barev.

Shrnutí - Northern vs Southern vs Western Blotting

Blotování je speciální technika vyvinutá pro identifikaci specifické DNA, RNA nebo proteinu ze vzorků. K detekci specifického typu molekuly existují tři samostatné blotovací postupy, konkrétně severní, jižní a západní. Technika Northern blottingu je navržena tak, aby detekovala specifickou sekvenci RNA ze směsi RNA. Technika Southern blotting umožňuje detekci specifické sekvence DNA ze vzorku DNA a byla vyvinuta technika western blot pro identifikaci specifického proteinu ze směsi proteinů.

Reference
1. Gibbons, Janay. "Western Blot: Přehled přenosu proteinů." North American Journal of Medical Sciences. Medknow Publications & Media Pvt Ltd, březen 2014. Web. 27.03.2017
2. Brown, T. „Southern blotting.“ Aktuální protokoly v imunologii. US National Library of Medicine, květen 2001. Web. 27.03.2017
3. On, Shan L. „Severní skvrna.“ Metody v enzymologii. US National Library of Medicine, 2013. Web. 27.03.2017

Obrázek se svolením:
1. „Northern Blot Scheme“ od RNA405 - vlastní práce (public domain) přes Commons Wikimedia
2. „Western blot 114A“ od Amanthabagdona - vlastní práce (Public Domain) přes Commons Wikimedia