Rozdíl mezi Sangerovým sekvenováním a pyrosekvenováním

Key Difference - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
 

Sekvenování DNA je velmi důležité pro analýzu DNA, protože znalost správného uspořádání nukleotidů v konkrétní oblasti DNA odhaluje mnoho důležitých informací o něm. Existují různé metody sekvenování DNA. Sangerovo sekvenování a pyrosekvenování jsou dvě různé metody sekvenování DNA široce používané v Molecular Biology. Klíčovým rozdílem mezi Sangerovým sekvenováním a pyrosekvenováním je to Sangerovo sekvenování používá dideoxynukleotidy k ukončení syntézy DNA ke čtení nukleotidové sekvence, zatímco pyroekvizování detekuje uvolňování pyrofosfátu začleněním nukleotidů a syntetizováním komplementární sekvence pro čtení přesného pořadí sekvence.

OBSAH
1. Přehled a klíčový rozdíl
2. Co je Sangerovo sekvenování
3. Co je to pyrosekvenování
4. Srovnání bok po boku - sekvenování Sangerů vs.
5. Shrnutí

Co je Sangerovo sekvenování?

Sangerova sekvenování je první generace DNA sekvenční metody vyvinuté Frederickem Sangerem a jeho školami v roce 1977. Je známá také jako Řetězec ukončení řetězce nebo Dideoxy sekvenování protože je založen na ukončení řetězce dideoxynukleotidy (ddNTP). Tato metoda byla široce používána více než 30 let, dokud nebyla vyvinuta sekvence nové generace (NGS). Technika Sangerova sekvenování umožnila objev správného pořadí nukleotidů nebo připojení konkrétního fragmentu DNA. Je založeno na selektivním začlenění ddNTP a ukončení syntézy DNA během DNA in vitro Replikace DNA. Nepřítomnost 3 'OH skupin pro pokračování tvorby fosfodiesterové vazby mezi sousedními nukleotidy je jedinečným znakem ddNTP. Jakmile je tedy připojen ddNTP, prodlužování řetězce přestane a končí od tohoto okamžiku. V sekvenci Sanger se používají čtyři ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP a ddTTP. Tyto nukleotidy zastavují proces replikace DNA, když jsou začleněny do rostoucího řetězce DNA a vedou k různým délkám krátké DNA. Kapilární gelová elektroforéza se používá k uspořádání těchto krátkých řetězců DNA podle jejich velikosti na gelu, jak je znázorněno na obrázku 01.

Obrázek 1: Kapilární gelová elektroforéza syntetizované krátké DNA

Pro in vitro Při replikaci DNA by mělo být stanoveno několik požadavků. Jsou to DNA polymerázový enzym, templátová DNA, oligonukleotidové primery a deoxynukleotidy (dNTP). Při Sangerově sekvenování se replikace DNA provádí ve čtyřech samostatných zkumavkách společně se čtyřmi typy ddNTP samostatně. Deoxynukleotidy nejsou zcela nahrazeny příslušnými ddNTP. Směs konkrétního dNTP (například; dATP + ddATP) je obsažena v zkumavce a replikována. Čtyři oddělené zkumavky se nanesou na gel ve čtyřech oddělených jamkách. Potom odečtením gelu může být sekvence zkonstruována, jak je znázorněno na obrázku 02.

Obrázek 02: Sangerovo sekvenování

Sangerovo sekvenování je důležitá technika, která pomáhá v mnoha oblastech molekulární biologie. Projekt lidského genomu byl úspěšně dokončen pomocí Sangerových sekvenčních metod. Sangerovo sekvenování je také užitečné při sekvenování cílové DNA, výzkumu rakoviny a genetických chorob, analýze genové exprese, identifikaci člověka, detekci patogenu, mikrobiálním sekvenování atd..

Sangerova sekvencování má několik nevýhod:

• Délka sekvenované DNA nesmí být delší než 1000 párů bází
• Najednou lze sekvenovat pouze jeden řetězec.
• Tento proces je časově náročný a nákladný.

Proto byly postupem času vyvinuty nové pokročilé techniky sekvenování, které tyto problémy překonaly. Sekvenování Sanger se však stále používá kvůli jeho velmi přesným výsledkům až do přibližně 850 fragmentů délky párů bází.

Co je to Pyrosequencing?

Pyrosekvenování je nová technika sekvenování DNA založená na „sekvenování syntézou“. Tato technika se spoléhá na detekci uvolňování pyrofosfátu po začlenění nukleotidů. Tento proces využívají čtyři různé enzymy: DNA polymerse, ATP sulfuryláza, luciferáza a apyráza a dva substráty adenosin 5 'fosfosulfát (APS) a luciferin.

Proces začíná vazbou primeru s jednovláknovým templátem DNA a DNA polymeráza zahajuje inkorporaci nukleotidů s ním komplementárních. Když se nukleotidy spojí (polymerizace nukleových kyselin), uvolní pyrofosfátové (dvě fosfátové skupiny vázané dohromady) a energii. Každé přidání nukleotidu uvolňuje ekvimolární množství pyrofosfátu. Pyrofosfát se přeměňuje na ATP sulfurázou ATP v přítomnosti substrátu APS. Generovaný ATP řídí luciferázou zprostředkovanou přeměnu luciferinu na oxyluciferin, čímž vytváří viditelné světlo v množství, které je úměrné množství ATP. Světlo je detekováno fotonovým detekčním zařízením nebo fotonásobičem a vytváří pyrogram. Apyráza degraduje ATP a nezačleněné dNTP v reakční směsi. Přidávání dNTP se provádí najednou. Protože přidání nukleotidů je známé podle inkorporace a detekce světla, může být stanovena sekvence templátu. Pyrogram se používá pro generování nukleotidové sekvence vzorku DNA, jak je znázorněno na obrázku 03.

Pyrosekvenování je velmi důležité při analýze jedno nukleotidového polymorfismu a sekvenování krátkých úseků DNA. Vysoká přesnost, flexibilita, snadná automatizace a paralelní zpracování jsou výhody pyroekvizování oproti technikám Sangerova sekvenování.

Obrázek 03: Pyrosekvenování

Jaký je rozdíl mezi Sangerovým sekvenováním a pyrosekvenováním?

Sekvenování Sanger vs Pyrosequencing
Sangerovo sekvenování je DNA sekvenční metoda založená na selektivním začlenění ddNTP pomocí DNA polymerázy a zakončení řetězce.	Pyrosekvenování je metoda sekvenování DNA založená na detekci uvolňování pyrofosfátu po inkorporaci nukleotidu.
Použití ddNTP
ddNTP se používají k ukončení replikace DNA	ddNTP se nepoužívají.
Enzymy zapojeny
Používá se DNA polymeráza.	Používají se čtyři enzymy: DNA polymeráza, ATP sulfurylasa, Luciferáza a apyráza.
Použité substráty
APS a Luciferin se nepoužívají.	Používají se adenosin 5 'fosfosulfát (APS) a luciferin.
Maximální teplota
Toto je pomalý proces.	Toto je rychlý proces.

Shrnutí - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing

Sangerovy sekvenování a pyrosekvenování jsou dvě metody sekvenování DNA používané v molekulární biologii. Sangerovo sekvenování konstruuje pořadí nukleotidů v sekvenci ukončením prodlužování řetězce, zatímco pyroesekvenování konstruuje přesné pořadí nukleotidů v sekvenci inkorporací nukleotidů a detekováním uvolňování pyrofosfátů. Proto je hlavní rozdíl mezi Sangerovým sekvenováním a pyrosekvenováním v tom, že Sangerovo sekvenování pracuje na sekvenování ukončením řetězce, zatímco pyrosekvenování funguje na sekvenování pomocí syntézy.

Odkaz:
1. Fakruddin, Md a Abhijit Chowdhury. "Pyrosequencing - alternativa k tradičním sekvencím Sanger." American Journal of Biochemistry and Biotechnology. Science Publications, 02.03.2012. Web. 28 únor 2017.
2. „Sangerovo sekvenování“. Sangerovo sekvenování - ScienceDirect Topics. N.p., n.d. Web. 28 únor 2017

Obrázek se svolením:
1. „Didesoxy-Methode“ Christoph Goemans (modifiziert) - Dr. Norman Mauder, auf Basis einer Datei Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) prostřednictvím Commons Wikimedia
2. „Sanger-DNA-seq“ Enzo na polském jazyce Wikipedia (CC BY-SA 3.0) přes Commons Wikimedia
3. „Pyrosekvenování“ pomocí mikrobiologických bytů (CC BY-SA 2.0) přes Flickr