Rozdíl mezi sekvenováním PCR a DNA

Klíčový rozdíl - PCR vs. sekvenování DNA
 

PCR a DNA sekvenování jsou dvě důležité techniky v Molecular Biology. Polymerázová řetězová reakce (PCR) je proces, který vytváří velké množství kopií fragmentu DNA. DNA sekvenování je technika, která vede k přesnému pořadí nukleotidů daného fragmentu DNA. Toto je klíčový rozdíl mezi PCR a sekvenováním DNA. PCR je jedním z hlavních kroků zapojených do sekvenování DNA.

OBSAH
1. Přehled a klíčový rozdíl
2. Co je to PCR
3. Co je sekvenování DNA
4. Porovnání bok po boku - PCR vs DNA Sequencing
5. Shrnutí

Co je to PCR?

Polymerázová řetězová reakce (PCR) je technika amplifikace DNA použitá v Molecular Biology. Vytváří tisíce až miliony kopií konkrétního fragmentu DNA. Tato metoda byla vyvinuta Kary Mullisem v roce 1983. V této technice fragment DNA, který má být amplifikován, slouží jako templát a enzym DNA polymerázy přidává komplementární nukleotidy k primeru, který je k dispozici ve směsi PCR. Na konci reakce PCR je syntetizováno mnoho kopií DNA vzorku.

Existují různé složky směsi PCR, včetně DNA, DNA polymerázy (Taq polymerázy), primerů (forward a reverzní primery), nukleotidů (stavební bloky DNA) a pufru. K PCR dochází uvnitř PCR stroje a do stroje by měla být naložena správná směs PCR a měl by se řídit správný program. Tato technika umožňuje výrobu tisíců až miliónů kopií určité části DNA z velmi malého množství DNA.

Reakce PCR probíhají cyklickým způsobem za vzniku viditelného množství produktů PCR na gelu. Do PCR reakce jsou zapojeny tři hlavní kroky, a to denaturace, hybridizace primerů a prodloužení řetězce, jak je znázorněno na obrázku 01. Tyto tři kroky se vyskytují při třech různých teplotách. DNA existuje ve dvouřetězcové formě vodíkovými vazbami mezi komplementárními bázemi. Před započetím by měla být dvouvláknová DNA od sebe oddělena. Provádí se to vysokou teplotou. Při vysoké teplotě se dvouřetězcová DNA denaturuje do jednotlivých řetězců. Pak by se primery měly přiblížit k lemujícím koncům specifického fragmentu nebo genu DNA. Primer je krátký kus jednovláknové DNA, která je komplementární k cílové sekvenci. Dopředné a reverzní primery nasedají s komplementárními bázemi na lemujících koncích denaturované DNA DNA při teplotě nasedání. Základní nátěry by měly být odolné vůči teplu. Jakmile primery nasedají se vzorkem DNA, enzym taq polymerázy zahajuje syntézu nových řetězců přidáním nukleotidů, které jsou komplementární k cílové DNA. Taq polymeráza je tepelně stabilní enzym izolovaný z termofilní bakterie zvané Thermus aquaticus. PCR pufr udržuje optimální podmínky pro působení taq polymerázy. Tyto tři fáze PCR reakcí se opakují, aby se vytvořilo požadované množství produktu PCR. Po každé PCR reakci se počet kopií DNA zdvojnásobí. Proto lze v PCR pozorovat exponenciální amplifikaci. Produkty PCR mohou být pozorovány gelovou elektroforézou a mohou být čištěny pro další studie.

Obrázek 01: Hlavní kroky PCR reakce

PCR je cenným nástrojem v lékařském a biologickém výzkumu. PCR má zvláštní hodnotu ve forenzní vědě, protože může amplifikovat DNA pro studie z malých vzorků od zločinců a vytvářet forenzní profily DNA. PCR je široce používána v mnoha oblastech molekulární biologie, včetně genotypizace, klonování genů, detekce mutací, sekvenování DNA, DNA čipů a testování otcovství atd..

Obrázek 02: Polymerázová řetězová reakce

Co je sekvenování DNA?

Sekvenování DNA je stanovení přesného pořadí nukleotidů - adeninu, guaninu, cytosinu a tyminu v daném fragmentu DNA. Genetická informace je uložena v sekvencích DNA pomocí správného pořadí nukleotidů. Nalezení přesného pořadí nukleotidů v fragmentu DNA je proto velmi důležité vědět o struktuře a funkci genů.

Protokol sekvenování DNA zahrnuje různé procesy. Prvním krokem je izolace zainteresované DNA nebo genomické DNA organismu. Použitím PCR (jak je popsáno výše) by měla být amplifikována požadovaná oblast DNA. Amplifikovaný produkt PCR by měl být separován gelovou elektroforézou a vyčištěn. Amplifikované fragmenty slouží jako šablony pro sekvenování. Sekvenování může být provedeno buď po Sangerově sekvenování nebo vysoce výkonném sekvenčním způsobu. Sangerovo sekvenování vyžaduje kapilární elektroforézu výsledných fragmentů DNA. Stanovení správného pořadí nukleotidů lze provést manuálním čtením autorádiografů nebo pomocí automatických sekvencerů DNA.

Genové sekvenování přispělo k projektu lidského genomu a usnadnilo mapování lidského genomu v roce 2003. V forenzní analýze umožnilo sekvenování DNA identifikaci jedinců, kteří vykazují jedinečné sekvence DNA a identifikují zločince. V medicíně lze sekvenování DNA použít k detekci genů zodpovědných za genetická a jiná onemocnění, nalezení defektních genů a jejich nahrazení správnými geny. V zemědělství se informace o sekvenování DNA některých mikroorganismů používají k produkci transgenních plodin s ekonomicky žádoucími vlastnostmi.

Obrázek 03: Sekvenování DNA

Jaký je rozdíl mezi sekvenováním PCR a DNA?

PCR vs DNA Sekvenování
Proces PCR vytváří tisíce až miliony kopií fragmentu DNA, který má zájem.	DNA sekvenování je proces určování přesného pořadí nukleotidů v daném fragmentu DNA.
Výsledek
PCR vytváří tisíce až miliony kopií konkrétního fragmentu DNA	To má za následek správné pořadí bází v konkrétním fragmentu DNA.
Zapojení ddNTP
PCR nevyžaduje ddNTP. Používá dNTP.	Sekvenování DNA vyžaduje ddNTP k ukončení tvorby řetězce.

Shrnutí - PCR vs DNA Sequencing

PCR a DNA sekvenování jsou velmi důležité nástroje v mnoha oblastech molekulární biologie. Amplifikace fragmentů DNA se provádí technikou PCR, zatímco správné pořadí nukleotidů fragmentu DNA je určeno sekvenováním DNA. Toto je rozdíl mezi PCR a DNA sekvenováním.

Odkaz:
1. „Polymerázová řetězová reakce (PCR).“ Národní centrum pro biotechnologické informace. U.S. National Library of Medicine, n.d. Web. 21. února 2017.
2. Shendure, Jay a Hanlee Ji. "Sekvenování DNA nové generace." Přírodní zprávy. Nature Publishing Group, 09 Říjen 2008. Web. 21. února 2017

Obrázek se svolením:
1. „Kroky PCR“ od Tinojasontran - vlastní práce (public domain) přes Commons Wikimedia
2. „Polymerázová řetězová reakce“ Enzoklop - vlastní práce (CC BY-SA 3.0) přes Commons Wikimedia
3. „DNA sekvence“ od Sjefa - vlastní práce (Public Domain) přes Commons Wikimedia