Rozdíl mezi RT PCR a QPCR

Klíčový rozdíl - RT PCR vs QPCR
 

Polymerázová řetězová reakce je technika používaná k amplifikaci specifické oblasti DNA in vitro. Díky vynálezu této techniky Kary Mullis v roce 1983 jsou vědci schopni pro výzkumné účely vyrobit tisíce až miliony kopií specifických fragmentů DNA. V současné době se stala běžnou a rutinně prováděnou technikou v klinických a výzkumných laboratořích pro širokou škálu aplikací. Existují variace tradiční techniky PCR, jako je RT PCR, vnořená PCR, multiplexní PCR, Q PCR, RT - QPCR atd. RT PCR a Q PCR jsou dvě důležité varianty PCR. Klíčovým rozdílem mezi RT PCR a Q PCR je to RT PCR se používá k detekci genové exprese vytvořenímkomplementární DNA (cDNA) přepisuje z RNA zatímco Q PCR se používá pro kvantitativní měření produktů PCR v reálném čase pomocí fluorescenčních barviv.

OBSAH
1. Přehled a klíčový rozdíl
2. Co je RT PCR
3. Co je QPCR
4. Porovnání bok po boku - RT PCR vs QPCR
5. Shrnutí

Co je RT PCR?

Reverzní transkripční polymerázová řetězová reakce (RT PCR) je varianta PCR, která se používá k detekci exprese RNA. Je to velmi důležitá metoda pro detekci exprese mRNA v tkáních. RT PCR se používá, když je výchozím materiálem RNA. V RT PCR je mRNA templátu nejprve převedena na komplementární DNA. Tento krok je katalyzován enzymovou reverzní transkriptázou a tento proces je známý jako reverzní transkripce. Za druhé, pro nově syntetizovanou cDNA pro amplifikaci se používá tradiční PCR.

RT PCR je vysoce citlivá technika, která vyžaduje relativně malé množství vzorku RNA. RT PCR se běžně používá při diagnostice a kvantifikaci druhů RNA, zejména RNA virů, jako je virus lidské imunodeficience a virus hepatitidy C.

Obrázek 01: RT PCR technika

Co je QPCR?

Kvantitativní PCR (QPCR) je varianta PCR, která se používá pro kvantitativní měření produktů PCR. Také se označuje jako polymerázová řetězová reakce v reálném čase, protože měří amplifikaci reálného času pomocí PCR stroje v reálném čase. Je to vhodný způsob pro stanovení množství cílové sekvence nebo genu přítomného ve vzorku. Zajímavým rysem QPCR je to, že kombinuje amplifikaci i skutečnou kvantifikaci do jednoho kroku. Potřeba gelové elektroforézy při detekci může být proto eliminována technikou QPCR. QPCR používá fluorescenční barviva k označení produktů PCR během PCR reakcí, které nakonec vedou k přímé kvantifikaci. Když se produkty PCR hromadí, fluorescenční signály se také hromadí a budou měřeny strojem v reálném čase. QPCR lze kombinovat s RT PCR. Je známá jako RT - QPCR nebo QRT - PCR a je považována za nejvýkonnější, nejcitlivější a kvantitativní metodu pro detekci hladin RNA v buňkách nebo tkáních..

SYBR Green a Taqman jsou dvě metody používané k detekci nebo sledování procesu amplifikace PCR v reálném čase. Metoda SYBR Green se provádí za použití fluorescenčního barviva zvaného SYBR green a detekuje amplifikaci vazbou barviva k produkci dvouvláknové DNA. Taqman se provádí pomocí duálně značených sond a detekuje amplifikaci degradací sondy pomocí Taq polymerázy a uvolňování fluoroforu, jak je znázorněno na obrázku 02. Obě metody monitorují průběh procesu amplifikace a vykazují množství produktu v reálném čase..

PCR v reálném čase má širokou škálu aplikací, jako je kvantifikace genové exprese, analýza RNA a nekódující RNA, genotypizace SNP, detekce variant počtu kopií, detekce vzácných mutací, detekce geneticky modifikovaných organismů, detekce infekčních agens atd..

Obrázek 02: Kvantitativní PCR technika

Jaký je rozdíl mezi RT PCR a QPCR?

RT PCR vs QPCR
RT PCR je technika používaná k detekci genové exprese amplifikací.	QPCR je technika, která amplifikuje DNA a kvantifikuje produkty PCR v reálném čase.
Zapojení enzymu reverzní transkriptázy
Enzymatická reverzní transkriptáza se používá pro RT PCR.	Enzymová reverzní transkriptáza se pro QPCR nepoužívá.
Použití fluorescenčně označených molekul
Fluorescenčně značená barviva nebo sondy se pro RT PCR nepoužívají.	Pro QPCR se používají fluorescenčně značená barviva nebo sondy.
Kvantifikace produktu PCR
Pokud není ve spojení s QPCR, RT PCR kvantifikuje produkt PCR.	QPCR kvantitativně měří produkt PCR.
Startovací materiál
Výchozím materiálem je mRNA.	Výchozím materiálem je DNA.
Syntéza cDNA
Během RT PCR je produkována komplementární DNA.	Během QPCR není produkována komplementární DNA.

Shrnutí - RT PCR vs QPCR

RT PCR a QPCR jsou dvě verze tradičních PCR. Technika RT PCR se provádí pro vzorky mRNA a je řízena reverzní transkripcí a produkcí cDNA. QPCR se používá k kvantifikaci produktů PCR během termálních cyklů PCR v reálném čase pomocí fluorescenčních barviv nebo značených sond. V QPCR je množství produktu PCR reprezentováno emitovanými fluorescenčními signály ze vzorku. RT PCR se běžně používá jako proces amplifikace, zatímco QPCR se běžně používá jako proces kvantifikace. Toto je rozdíl mezi RT PCR a QPCR.

Reference:
1. Deepak, SA, KR Kottapalli, R. Rakwal, G. Oros, KS Rangappa, H. Iwahashi, Y. Masuo a GK Agrawal. "Real-time PCR: Revoluční detekce a exprese analýza genů." Současná genomika. Bentham Science Publishers Ltd., červen 2007. Web. 03. dubna 2017
2. Zeka, Fjoralba, Katrien Vanderheyden, Els De Smet, Claude A. Cuvelier, Pieter Mestdagh a Jo Vandesompele. "Přímočará a citlivá analýza genové exprese vzorků FFPE založená na RT-qPCR." Přírodní zprávy. Nature Publishing Group, 22. února 2016. Web. 03. dubna 2017
3. Overbergh, L., A. Giulietti, D. Valckx, B. Decallonne, R. Bouillon a C. Mathieu. "Použití real-time reverzní transkriptázy PCR pro kvantifikaci exprese cytokinového genu." Journal of Biomolecular Techniques: JBT. Asociace zařízení pro biomolekulární zdroje, březen 2003. Web. 03. dubna 2017

Obrázek se svolením:
1. „Taqman“ uživatelem: Braindamaged - vlastní dílo původního uživatele, který nahrál video (public domain) přes Commons Wikimedia
2. „Reverzní transkripční polymerázová řetězová reakce“ autorem Jpark623 - vlastní práce (CC BY-SA 3.0) přes Commons Wikimedia